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蛋白层析柱使用操作快速指南主要包括四个部分

发布时间:2020-04-20   点击次数:141次
  缓冲液准备
  1.冲洗缓冲液(0.1M磷酸钠,pH7.2)。要避免缓冲液中含NaCl。配好的缓冲液放置于4℃保存。
  2.洗脱缓冲液(0.1M磷酸钠,0.1M氟化钠,pH7.2)。使用注射器时,洗脱缓冲液需保存在4℃。
  3.清洗缓冲液(0.1M磷酸)。
  4.保存缓冲液(0.02%叠n化钠,0.1M磷酸钠,pH7.2)。
  蛋白层析柱的上样和冲洗
  1.从柱子端部拿掉塞子,保存好这些塞子,备用。
  2.用10倍柱体积冲洗缓冲液平衡柱子。因为保存缓冲液中含有0.02%的叠n化钠用来抑菌,为了去除叠n化物对离子的激发作用,这步预平衡是必须的。使针筒充满冲洗缓冲液,插入柱子并把所有缓冲液推入柱子。
  3.预冷(4℃)的细胞裂解液上柱。使针筒充满裂解液,插入柱子并把所有裂解液推入柱子。对于1ml柱子,可以上5ml的裂解液。
  4.用15倍柱体积冲洗缓冲液冲洗柱子。使冲洗缓冲液充满针筒,插入柱子并把所有的缓冲液推入柱子。这步可以根据纯化蛋白的需要增加额外的冲洗步骤。
  洗脱
  1.使针筒充满6倍柱体积的洗脱缓冲液,先把1.5倍柱体积的洗脱缓冲液上柱。收集1.5倍柱体积的流出液,每部分0.5倍柱体积,对其进行分析。在第二部分收集液中通常会含有一些纯化的蛋白。针筒也可以留在柱子上,用塞子塞住出口。
  2.在室温下,用洗脱缓冲液孵育柱子至少30分钟。如果在4℃下孵育,则至少孵育12小时。
  3倍柱体积洗脱缓冲液上柱。通常大量的蛋白会在前面五部分洗脱缓冲液中被洗脱出来。
  清洗
  1.用至少5倍柱体积的冲洗缓冲液冲洗柱子。
  2.用3倍柱体积的清洗缓冲液清洗柱子。
  3.用5倍柱体积冲洗缓冲液平衡柱子。
  4.用2倍柱体积保存缓冲液平衡柱子;盖好柱子并保存于4℃。
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