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蛋白层析柱高效使用与精准维护攻略

更新时间:2025-06-26浏览:67次

蛋白层析柱高效使用与精准维护攻略
一、装柱与平衡阶段注意事项  
层析柱预处理  
清洁与灭菌:使用前,用去离子水冲洗柱管及配件,去除杂质;需灭菌时,采用高压蒸汽灭菌(121℃,20分钟)或乙醇浸泡(75%乙醇,≥30分钟),确保无菌环境。  
垫片与筛板检查:检查筛板是否平整、无破损,垫片需紧密贴合柱壁,避免漏液或蛋白泄漏。  
填料装填技巧  
填料预处理:根据说明书,用缓冲液平衡填料(如Sepharose需悬浮于20%乙醇),去除气泡并调整至合适浓度(如10-50%悬浮液)。  
装柱方法:  
采用“湿法装柱”,缓慢倒入填料,避免分层或气泡。  
装填后用缓冲液轻柔冲洗,流速≤1ml/min(小柱)至≤10ml/min(大柱),直至基线平稳(UV280nm吸收值≤0.01AU)。  
平衡条件优化  
缓冲液选择:与样品缓冲液成分一致(如pH、离子强度),避免蛋白沉淀或变性。  
平衡体积:至少5倍柱体积(CV),复杂填料(如离子交换)需10-15倍CV,确保填料表面电荷或配基充分平衡。  
 

 

二、蛋白层析柱上样与洗脱阶段注意事项  
样品预处理  
澄清过滤:样品需经0.22μm或0.45μm滤膜过滤,去除颗粒物,防止堵塞筛板。  
浓度与体积:上样量≤填料动态结合载量(如DEAE填料蛋白载量10-50mg/ml),体积≤5%柱体积,避免过载导致峰形展宽。  
流速与压力控制  
操作压力:维持柱压≤0.3MPa(常规柱),压力骤升(>0.5MPa)需立即停泵,检查是否堵塞。  
流速优化:  
分子筛层析:流速0.5-2ml/min(小柱),保持线性流速≤150cm/h。  
离子交换/亲和层析:流速1-5ml/min,平衡与洗脱流速需一致。  
洗脱策略  
梯度洗脱:离子交换层析采用线性盐梯度(如0-1MNaCl),亲和层析用竞争性洗脱液(如咪唑、甘氨酸),需预实验确定最佳梯度。  
收集管理:按峰收集,每管体积≤1/10柱体积,合并主峰并检测蛋白浓度(如Bradford法)。  
三、清洗与再生注意事项  
常规清洗  
缓冲液冲洗:每次运行后,用2-3倍CV起始缓冲液冲洗,去除残留蛋白。  
高盐清洗:离子交换柱用1-2MNaCl冲洗,去除非特异性结合蛋白。  
深度再生  
酸碱处理:  
离子交换柱:0.1-0.5MNaOH(碱性填料)或0.1-1MHCl(酸性填料),浸泡30分钟至2小时。  
亲和柱:根据配基特性选择(如His标签柱用0.1MEDTA解离金属离子)。  
有机溶剂清洗:疏水层析柱可用20-50%乙醇冲洗,去除脂类或疏水性杂质。  
消毒与保存  
消毒:长期存放前,用0.02%叠氮钠或20%乙醇冲洗并保存,防止微生物污染。  
冻存:特殊填料(如抗体亲和柱)可冻存于-20℃(含50%甘油),但需验证填料稳定性。  
四、蛋白层析柱常见问题与避坑指南  
峰形异常处理  
拖尾峰:可能原因包括填料过载、流速过快或柱效下降。解决方法:减少上样量、降低流速或更换新柱。  
肩峰或分裂峰:填料不均一或样品聚集导致。解决方法:重新装柱或优化样品缓冲液(如添加助溶剂)。  
柱效下降应对  
柱压升高:筛板堵塞时,反向冲洗(低流速)或更换筛板;填料压实则需重新装柱。  
分辨率降低:填料老化需更换,或优化缓冲液条件(如pH、离子强度)。  
蛋白损失预防  
非特异性吸附:增加平衡体积或添加非离子去污剂(如0.05%Tween-20)。  
机械泄漏:定期检查柱接头、垫片,紧固或更换密封件。

 

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